Grégoire Colin débute au théâtre en 1988, et au cinéma deux ans plus tard. Il est remarqué en adolescent prostitué dans Olivier, Olivier (1992) d’Agnieszka Holland.
En 1994, il incarne le fils d’Anémone dans Pas très catholique (1994) de Tonie Marshall, et un jeune moine orthodoxe dans Before the Rain de Milcho Manchevski. Il est aussi du casting de La reine Margot de Patrice Chéreau.
Jeune noble espagnol dans Fiesta (1995) de Pierre Boutron, provincial timide dans Le fils de Gascogne (1996) de Pascal Aubier, frère de Sandrine Bonnaire dans Secret défense (1998) de Jacques Rivette, Grégoire Colin aborde aussi le cinéma de Claire Denis.
Elle le dirige dans Nénette et Boni (1996) et Beau travail (1999), saisissant portrait d’un groupe de légionnaires.
Grégoire Colin joue ensuite l’amoureux de toxique de Natacha Régnier dans La vie rêvée des anges (1998) d’Erick Zonca et un révolutionnaire dans Sade (2000) de Benoit Jacquot. On le voit aussi tenir le rôle principal de plusieurs films d’auteurs, tels Sex is comedy (2001) de Catherine Breillat, Inquiétudes (2003) de Gilles Bourdos, ou Le tueur (2007) de Cédric Anger.
Par la suite, Grégoire Colin alterne premier et seconds rôles. Cosaque dans Voleurs de chevaux (2007) de Micha Wald, libertin dans Les salauds (2013) de Claire Denis, il est dans la peau de Jean Cocteau pour Opium (2013) d’Arielle Dombasle, qui relate les amours entre le poète et l’écrivain Raymond Radiguet.
On le voit également en imprésario de Barbara (2017) pour Mathieu Amalric, et en reporter de guerre dans Camille (2019) de Boris Lojkine.
