Hélène Vincent mène un brillant parcours théâtral depuis 1966, ayant notamment collaboré avec Patrice Chéreau et Jean-Pierre Vincent, qui fut son époux. Elle a elle-même assuré des mises en scène.
Elle débute au cinéma avec René Allio qui la dirige dans Pierre et Paul (1969) et Les camisards (1972), mais la comédienne fréquente peu les plateaux de cinéma pendant vingt ans, se consacrant davantage à la scène et à la télévision. On la voit toutefois dans de petits rôles, au gré d’une scène dans Que la fête commence (1975) de Bertrand Tavernier ou Cocktail molotov (1980) de Diane Kurys. Le triomphe surprise de la comédie La vie est un long fleuve tranquille (1988) d’Étienne Chatiliez élargit son audience : elle y interprète Mme Le Quesnoy, bourgeoise catholique dépassée par les événements, aux répliques désormais culte : « Le lundi, c’est ravioli », « Ne jurez-pas, Marie-Thérèse ». Elle remporte le César de la meilleure actrice dans un second rôle.
Elle tient ensuite des emplois de femmes entre deux âges, partagées entre retenue et excentricité, dans Les maris, les femmes, les amants (1989) de Pascal Thomas, ou J’embrasse pas (1991) d’André Téchiné. Dans ce film, elle campe l’infirmière attirée par le jeune provincial joué par Manuel Blanc, et obtient une nomination au César du second rôle. On la voit ensuite dans une dizaine d’autres métrages des années 90, dont Trois couleurs : Bleu (1993) de Krzysztof Kieślowski et Ma vie en rose (1996) d’Alain Berliner. Sœur de Jean Rochefort dans Le bal des casse-pieds (1991) d’Yves Robert ou mère de Bernie (1996) pour Albert Dupontel, elle devient un visage familier du cinéma français.
Hélène Vincent poursuit sa carrière au cinéma dans les années 2000 et 2010, jouant dans des films aussi divers que Saint-Jacques… La Mecque (2005) de Coline Serreau et Les petits ruisseaux (2010) de Pascal Baraté. Sa prestation de mère malade de Vincent Lindon dans Quelques heures de printemps (2012) la voit nommée au César de la meilleure actrice, mais c’est dans les seconds rôles qu’elle est le plus souvent employée, avec une prédilection pour les personnages de mère : de Mathilde Seigner dans Trésor (C. Berri et F. Dupeyron, 2009), de Sami Bouajila dans Good Luck Algeria (2015), de Valérie Lemercier dans Marie-Francine (2017), du marié dans Le sens de la fête (E. Todelano et O. Nakache, 2017), de victime dans Grâce à Dieu (2019) de François Ozon, ou d’ado autiste dans Hors normes (2019) d’E. Todelano et O. Nakache, pour lequel elle est nommée aux César.
Depuis, on l’a revue dans la comédie sociale Mine de rien (Mlekuz, 2020) et surtout la comédie trash de Laurent Lafitte intitulée L’origine du monde (2020).
Elle retrouve un premier rôle digne de son talent, grand-mère équivoque dans Quand vient l’automne (Ozon, 2024).
Elle est la mère du réalisateur Christian Vincent.
