D’une solide formation théâtrale, Alfred Molina intègre la Royal Shakespeare Company en 1977 et aborde le cinéma deux ans plus tard. Il obtient des rôles secondaires dans Les aventuriers de l’arche perdue (1981) de Steven Spielberg et Ladyhawke, la femme de la nuit (1985) de Richard Donner, et élargit son audience en interprétant l’amant de Gary Oldman dans Prick Up Your Ears (1987) de Steven Frears.
Dès lors, Alfred Molina devient l’un des seconds rôles les plus recherchés du cinéma anglais et de Hollywood. Parmi ses meilleurs films des années 90, on peut citer Avril enchanté (1992) de Mike Newell, Maverick (1994) de Richard Donner, Dead Man (1995) de Jim Jarmusch, Boogie Nights (1997) et Magnolia (1999) de Paul Thomas Anderson.
Par la suite, Alfred Molina incarne notamment le maire dans Le chocolat (2000) de Lasse Hallström, l’époux de Salma Hayek dans Frida (2002) de Julie Taymor, le docteur Octopus dans Spider-Man 2 (2004) de Sam Raimi, et le père de Carey Mulligan dans Une éducation (2009) de Lone Scherfig.
Dans les années 2010, Alfred Molina est au casting d’une vingtaine de films mais les rôles marquants sont rares. On le remarque tout au plus en organisateur de courses d’autruches dans Prince of Persia : Les sables du temps (2010) de Mike Newell, ou en serveur dans Vice (2018) d’Adam McKay. Il tourne aussi avec Ira Sachs, John Singleton, Carl Franklin et Fabrice du Welz.