Julie Gayet suit diverses formations dont le théâtre-école de Tania Balachova et des études de cinéma à la Sorbonne.
Elle débute au grand écran en 1993 dans des films de Costa-Gavras, Kieslowski, Antoine Desrosières et Philippe Harel, puis tourne avec Agnès Varda (Les Cent et Une Nuits de Simon Cinéma, 1995) et Élie Chouraqui (Les Menteurs, 1996).
Julie Gayet obtient le premier rôle dans Delphine 1, Yvan 0 (1996) de Dominique Farrugia. L’année suivante, Select Hôtel de Laurent Bouhnik lui permet d’être récompensée aux Festivals de Bruxelles et Kiev, et d’obtenir le prix Romy-Schneider.
Parmi la quarantaine de films qu’elle tourne par la suite, on peut citer La Confusion des sentiments (2000) d’Ilan Duran Cohen, Mon meilleur ami (2006) de Patrice Leconte, Un baiser, s’il vous plait (2007) d’Emmanuel Mouret et 8 fois debout (2009) de Xabi Molia, qui lui vaut le prix d’interprétation au Festival de Tokyo.
Elle est également dirigée par Jean-Charles Tacchella, Michel Deville, Merzak Allouache et Denys Granier-Deferre, et se voit nommée au César de la meilleure actrice dans un second rôle pour Quai d’Orsay (2013) de Bertrand Tavernier.
Julie Gayet a également produit une quinzaine de longs métrages dont Le Trésor de Corneliu Porumboiu et Mimosas d’Oliver Laxe. On l’a par ailleurs vue au théâtre et à la télévision.