Formé à l’école de théâtre La Scaletta à Rome, Stefano Dionisi débute à la télévision italienne en 1986. Il aborde le cinéma en 1990, interprétant le petit ami de Nastassja Kinski dans Il segreto de Francesco Maselli. Il est ensuite considéré comme l’un des jeunes acteurs les plus prometteurs du cinéma italien avec des films de Peter Del Monte, Maurizio Bonuglia, Sherry Hormann ou Pasquale Pozzessere.
Stefano Dionisi est le partenaire de Penélope Cruz dans La ribelle (1993) d’Aurelio Grimaldi et celui de Mastroianni dans Pereira prétend (1995) de Roberto Faenza. L’Académie des David di Donatello lui décerne un prix spécial de la jeunesse en 1994. C’est également l’année où Stefano Dionisi trouve son rôle le plus célèbre, dans Farinelli de Gérard Corbiau. Cette biographie romancée du célèbre castrat italien trouve un certain écho auprès du public.
À cette période, l’acteur alimente aussi la presse people, pour ses idylles avec l’actrice Chiara Caselli ou la productrice Annie Stewart. Pourtant, Stefano Dionisi va connaître un déclin, avec des seconds rôles dans des films sans relief, tels La fin de l’innocence sexuelle (1999) de Mike Figgis ou Les enfants du siècle (1999) de Diane Kurys. Une dépression nerveuse amplifie le phénomène.
On le voit tout de même en tête d’affiche du film d’horreur Le sang des innocents (2001) de Dario Argento, et du biopic Antonio Vivaldi, un prince à Venise (2006) de Jean-Louis Guillermou, aux côtés de Michel Serrault. Dans les années 2010, il tourne surtout pour la télévision. Au cinéma, il est à l’affiche de productions mineures comme La madre (2013) d’Angelo Maresca, où il a pour partenaire Carmen Maura. En 2021, Stefano Dionisi rejoint le prestigieux casting de Tre piani de Nanni Moretti, en compétition officielle au Festival de Cannes.
