Formé au cours Florent et au Conservatoire national supérieur d’art dramatique, Guillaume Gallienne intègre la Comédie-Française en 1998. Il est nommé pensionnaire et devient le 513e sociétaire en 2005. Il devient alors l’un des membres prestigieux de la troupe en tant que comédien et metteur en scène. Un fil à la patte de Feydeau, mis en scène par Jérôme Deschamps, lui vaut le Molière du comédien dans un second rôle en 2010.
Guillaume Gallienne triomphe avec sa pièce Les garçons et Guillaume… à table ! L’œuvre, autobiographique, est une réflexion sur l’identité de genre. Il en réalise une version cinématographique, au titre éponyme, en 2013. Le long métrage, initialement présenté à la Quinzaine des Réalisateurs, est un grand succès en salle et obtient quatre César : meilleur film, meilleur acteur, meilleure adaptation et meilleur premier film.
Son second long métrage en tant que réalisateur, Maryline (2017), est tout aussi ambitieux mais est accueilli plus tièdement par la critique, tout en ne trouvant pas son public.
En tant qu’acteur, Guillaume Gallienne avait débuté au cinéma en 1992 et joué des petits rôles pour Sydney Pollack, Claude Lelouch ou François Dupeyron. Parmi ses films, on peut citer Jet Set (2000) de Fabien Onteniente, Marie-Antoinette (2006) de Sofia Coppola et Musée haut, musée bas (2008) de Jean-Michel Ribes.
En 2014, il interprète Pierre Bergé dans le biopic Yves Saint Laurent de Jalil Lespert qui lui permet de gagner le prix Patrick Dewaere et d’être nommé au César du meilleur acteur dans un second rôle. On le revoit dans d’autres œuvres dont Cézanne et moi (2016) de Danièle Thompson et The French Dispatch (2021) de Wes Anderson.