Acteur américain, Stuart Margolin débute à la télévision en 1961, et au cinéma quelques années plus tard. On le sollicite pour des seconds rôles dans plusieurs productions. Il est ainsi militaire dans De l’or pour les braves (1970) de Brian G. Hutton et L’aigle fer II (1988) de Sidney J. Furie. On le croise en cow-boy dans Le flambeur (1974) de Karel Reisz ou en contremaître dans Les moissons du ciel (1978) de Terrence Malick.
Il joue aussi dans Un justicier dans La ville (1974) de Michael Winner, S.O.B. (1981) de Blake Edwards et La liste noire (1991) d’Irwin Winkler. Stuart Margolin obtient en 1979 et 1980 l’Emmy Award du meilleur acteur dans un second rôle pour une série dramatique avec Deux cent dollars plus les frais.
En parallèle, l’acteur mène une carrière de réalisateur, surtout pour la télévision. À partir des années 1990, il se fait plus rare au cinéma. Son dernier rôle est dans la série télévisée X-Files, en 2018. Stuart Margolin est décédé le 12 décembre 2022 à l’âge de 82 ans.