Actrice allemande, Juliane Köhler est formée au cours d’art dramatique d’Uta Hagen à New York et au H. B. Schauspielstudio. Elle mène un parcours théâtral régulier, et débute au cinéma en 1992. Elle se fait remarquer dans Aimée et Jaguar (1999) de Max Färberböck, récit lesbien relatant les amours d’une aryenne et d’une juive pendant la Seconde Guerre mondiale.
Pour ce film, elle remporte l’Ours d’argent de la meilleure actrice au Festival de Berlin, et le German Film Award dans la même catégorie. Elle est aussi la protagoniste de Nowhere in Africa (2001) de Caroline Link, sorti en France en 2004 sous le titre Une enfance africaine.
Le public français la connaît davantage pour son rôle d’Eva Braun dans La chute (2004) d’Oliver Hirschbiegel, dont elle partage l’affiche avec Bruno Ganz. Juliane Köhler est encore en tête d’affiche dans D’une vie à l’autre (2012) de Georg Maas et Judith Kaufmann, aux côtés de Liv Ullmann.
Elle tient aussi des seconds rôles remarqués dans Une femme à Berlin (2008) de Max Färberböck, Adam Resurrected (2008) de Paul Schrader, et Ultimatum (2016) d’Eric Poppe. En 2021, Juliane Köhler rejoint le casting de France de Bruno Dumont, sélectionné en compétition officielle au Festival de Cannes.