Actrice américaine, Charlotte Stewart a étudié l’art dramatique à Pasadena durant les années 50. Elle débute sa carrière à la télévision en 1960 et enchaîne les rôles. Au grand écran, on la voit pour la première fois dans le drame V.D. (Chace, 1961), puis dans un rôle de standardiste dans le film de Sydney Pollack 30 minutes de sursis (1965) avec Sidney Poitier. On la retrouve ensuite dans la comédie Quatre fiancés pour un mari (Tewksbury, 1967), À plein tube (Taurog, 1968) avec Elvis Presley et Attaque au Cheyenne Club (Kelly, 1970).
Toutefois, c’est la télévision qui fait souvent appel à elle et elle décroche le rôle récurrent de l’institutrice dans la série très populaire La petite maison dans la prairie. Cela lui apporte une belle notoriété auprès du grand public.
A la même époque, elle fait confiance à un jeune metteur en scène débutant nommé David Lynch qui lui donne un rôle majeur dans son étrange Eraserhead (1977). Le film tourné durant cinq longues années deviendra culte. Ensuite, Charlotte Stewart tourne de moins en moins pour le cinéma si l’on excepte la comédie Buddy Buddy de Billy Wilder (1981) ou le film d’horreur Tremors (Underwood, 1990). David Lynch lui offre un court rôle dans sa série Twin Peaks. Après de nombreux travaux télé, on peut l’identifier dans Les taudis de Beverly Hills (Jenkins, 1998), le produit vidéo Tremors 3 : Le retour (Maddock, 2001) et elle reprend son rôle de Betty Briggs dans la série Twin Peaks : The Return en 2017, toujours sous la direction de David Lynch.
