Justin Theroux débute en 1996 dans I Shot Andy Warhol de Mary Harron. Après un second rôle remarqué dans American Psycho (2000) de la même réalisatrice, il trouve son rôle le plus célèbre en incarnant le cinéaste manipulé dans Mullholland Drive (2001) de David Lynch.

Par la suite, il tourne une vingtaine de films. Il fait partie du casting de Charlie’s Angels : Les Anges se déchaînent ! (2003) de McG, joue un inspecteur dans Miami Vice : Deux Flics à Miami (2006) de Michael Mann, et retrouve la même année David Lynch dans Inland Empire. Plus tard, il apparaît dans Zoolander 2 (2016) de Ben Stiller, dont il est le coscénariste, et interprète Master Codebreaker dans Star Wars, épisode VIII : Les Derniers Jedi (2017) de Rian Johnson.

Justin Theroux a également été vu dans des séries télévisées (Ally McBeal, Sex and the City).