Acteur mexicain, Diego Luna débute au cinéma en 1994. On le remarque dans Avant la nuit (2000) de Julian Schabel, et Y tu mamá también (2001) d’Alfonso Cuarón, où il partage l’affiche avec Gael García Bernal, son pote dans le film et la vraie vie.
Hollywood fait ensuite appel à lui pour des seconds rôles, et Diego Luna se retrouve au générique du biopic Frida (2002) de Julie Taymor, et du western Open Range (2003) de Kevin Costner. Il interprète aussi l’amoureux transi dans Le terminal (2004) de Steven Spielberg, puis Jack Lara, amant de Sean Penn dans Harvey Milk (2008) de Gus Van Sant.
Dans les années 2010, Diego Luna se lance dans la réalisation avec le drame social Abel (2001), présenté en séance spéciale dans la sélection officielle du Festival de Cannes. Il est aussi l’auteur du biopic Cesar Chávez (2014), inédit en France, et du drame Sr. Pig (2016), interprété par Danny Glover, diffusé sur Netflix en 2019.
En tant qu’acteur, il apparaît dans une dizaine de films. Il est particulièrement remarquable en ignoble trafiquant dans Blood Father (2016) de Jean-François Richet, dans lequel il affronte Mel Gibson. On l’apprécie également dans le rôle du célèbre acteur qui séduit Elle Fanning dans Un jour de pluie à New York (2019) de Woody Allen.